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產(chǎn)品名稱：

英文名稱：Xylophilus ampelinus PCR Kit

中文名稱：葡萄細(xì)菌性疫病菌PCR試劑盒

包裝規(guī)格：50T/盒

預(yù)期用途

細(xì)菌性疫病是由黃單孢桿菌（屬細(xì)菌）侵染所致。病菌主要在種子內(nèi)越冬，也可隨病殘?bào)w在土壤中越冬。本產(chǎn)品就是根據(jù) PCR 原理開(kāi)發(fā)檢測(cè)葡萄細(xì)菌性疫病菌的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開(kāi)即用，用戶只需要提供 DNA 模板。

2. 引物經(jīng)過(guò)精心優(yōu)化，專一性強(qiáng)，只擴(kuò)增葡萄細(xì)菌性疫病菌，與其他細(xì)菌沒(méi)有交叉反應(yīng)。

3. 提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. PCR mix 中含上樣染料，PCR 后可以直接上樣電泳。

5. 本試劑盒足夠做 40μL 體系的 PCR 50 次，但只能用于科研。

葡萄細(xì)菌性疫病菌PCR試劑盒檢驗(yàn)原理

本試劑盒采用 PCR 技術(shù)，針對(duì)葡萄細(xì)菌性疫病菌的基因高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，用 PCR 技術(shù)對(duì)葡萄細(xì)菌性疫病菌的核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)，在反應(yīng)體系中含葡萄細(xì)菌性疫病菌核酸模板的情況下，PCR 反應(yīng)進(jìn)行特異性擴(kuò)增，利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對(duì) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，依據(jù)特異性擴(kuò)增片段的結(jié)果，判斷待檢樣品中是否含有豬細(xì)小病毒源性成分，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析。

試劑組成：

名稱	規(guī)格
葡萄細(xì)菌性疫病菌擴(kuò)增液	50μL×1管
葡萄細(xì)菌性疫病菌反應(yīng)液	950μL×1管
葡萄細(xì)菌性疫病菌陽(yáng)性質(zhì)控品	50μL×1管
葡萄細(xì)菌性疫病菌陰性質(zhì)控品	50μL×1管
說(shuō)明書(shū)	1份

實(shí)驗(yàn)說(shuō)明

1. 不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。

2. 試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測(cè)次數(shù)。

儲(chǔ)存條件及有效期

-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融少于 7 次，有效期 12 個(gè)月。

適用儀器

無(wú) DNA/RNA 酶的 1.5mL 離心管，0.2mL PCR 反應(yīng)管，濾芯吸頭(規(guī)格:10μL,200μL,1000μL)，離心機(jī)，振蕩混合器，各種規(guī)格的移液器，瓊脂糖，電泳槽，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)。

樣品要求

1. 根據(jù)實(shí)際情況可采取食品、糞便、嘔吐物、口腔樣本，唾液、咽喉部鼻孔眼部和肛門(mén)拭子及病毒培養(yǎng)物作為檢測(cè)樣本。

2. 應(yīng)避免樣本間交叉污染，樣本采集后應(yīng)及時(shí)檢測(cè)，也可保存于-20±5℃待檢，長(zhǎng)期保存應(yīng)置于-70℃以下。

樣品保存和運(yùn)輸

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但不能超過(guò) 6 個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

使用方法

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

2. 樣本前處理

取懸浮的口腔樣本或糞便樣本 100ul，加入 1.5ml 離心管中，用 DNA 核酸提取試劑盒進(jìn)行提取即可。

DNA 提取

根據(jù)您實(shí)驗(yàn)室的具體情況和樣品類型，選擇適當(dāng)?shù)奶崛〔呗苑椒ā榱耸箤?shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、有效、可靠，我們建議使用商品化的試劑盒進(jìn)行提取，嚴(yán)格按照對(duì)應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，樣本核酸提取過(guò)程中應(yīng)避免污染，提取好的模板樣品如不能立即檢測(cè)，建議-15℃以下保存。

推薦采用我們公司研發(fā)生產(chǎn)的試劑盒：Hypure 病毒基因組 DNA 提取試劑盒(離心柱法) 

試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

1. 從-15℃以下冰箱中取出試劑盒平衡到室溫（20～25℃），注意避免強(qiáng)光照射，待完全溶解后振蕩混勻并低速離心 10 s，使用低吸附吸頭分液取樣，避免試劑損失和浪費(fèi)。

2. 根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測(cè)試反應(yīng)體

系配制如下表：

試劑	葡萄細(xì)菌性疫病菌反應(yīng)液	葡萄細(xì)菌性疫病菌擴(kuò)增液
用量（樣本數(shù)為N）	19μL	1μL

3. 在適當(dāng)容積的無(wú)菌離心管中加入上述試劑，充分振蕩混勻后 2000 rpm 離心 10 s，按照 20 μL/管分裝量將試劑分裝至八聯(lián) PCR 反應(yīng)管中。

4. 蓋緊八聯(lián) PCR 反應(yīng)管蓋, 并注意做好相應(yīng)標(biāo)識(shí)（請(qǐng)標(biāo)記在八聯(lián) PCR 反應(yīng)管蓋兩端突出部位，切勿標(biāo)記在八聯(lián) PCR 反應(yīng)管蓋中間）。將 PCR 反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本準(zhǔn)備區(qū)，剩余試劑放回-15℃以下冰箱冷凍保存。

加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 DNA、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL，加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心，核酸加樣過(guò)程中應(yīng)避免污染。

備注：模板濃度高或存在 PCR 抑制物，需用超純水稀釋模板 DNA，DNA 濃度低于 50ng/ul，可加 5μL 模板，高濃度 DNA 可能抑制 PCR 反應(yīng)。

PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

將待檢測(cè)反應(yīng)管置于 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi), 并記錄放置順序；

推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟	循環(huán)數(shù)	溫度	時(shí)間
1	1 cycle	95℃	3min
2	35 cycle	95℃	10sec
		58℃	15sec
		72℃	20sec
3	1 cycle	72℃	5min
4	1 cycle	4℃	Hold

結(jié)果分析判定

電泳檢測(cè)

取 10-20 μL PCR 產(chǎn)物。電泳檢測(cè) PCR 產(chǎn)物。本產(chǎn)品提供的擴(kuò)增液在擴(kuò)增結(jié)束后可以直接上樣，不需要另外再加 loading buffer。

電泳結(jié)果判斷

PCR 產(chǎn)物陽(yáng)性對(duì)照必須有目的片段大小的條帶出現(xiàn)，陰性對(duì)照必須無(wú)任何擴(kuò)增，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效。對(duì)沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物的樣品，可以稀釋 10 倍后重復(fù) PCR 擴(kuò)增以排除PCR 抑制劑的感染。

檢測(cè)方法的局限性

* 樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

* 樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；

* 陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；

* 不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

* 試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果。

注意事項(xiàng)

* 所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；

* 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，混勻并短暫離心；

* 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

* 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

* 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

* 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

* 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；

* 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。

特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，試劑盒嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！