乙型肝炎病毒前基因組RNA探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

Hepatitis B Virus Pregenomic RNA (HBV pgRNA) Probe qRT-PCR Kit

產(chǎn)品及特點(diǎn)；

乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus ，HBV）是一種  RNA 病毒 ， 會引起乙 型病毒性肝炎 ， 是一種以肝臟病變?yōu)橹鞯膫魅静?。臨床上以食欲減退、惡心、上 腹部不適、肝區(qū)痛、 乏力為主要表現(xiàn) 。部分患者可有黃疸發(fā)熱和肝大伴有肝功能 損害有些患者可慢性化 ，甚至發(fā)展成肝硬化 ， 少數(shù)可發(fā)展為肝癌 ， 對人體生命健 康造成嚴(yán)重?fù)p害 。本產(chǎn)品以探針法熒光定量  RT-PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測乙型肝炎病毒前基因組  RNA  的試劑盒 ，它具有下列特點(diǎn)：
1.    即開即用 ， 用戶只需要提供樣品 RNA 模板。
2.    引物和探針經(jīng)過優(yōu)化 ，分析靈敏性高。
3.   提供陽性對照 ， 便于區(qū)分假陰性樣品。
4.   特異性高 ， 引物是根據(jù)乙型肝炎病毒前基因組 RNA 高度保守區(qū)設(shè)計 ， 不會跟其他病毒的 RNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。
5.   既可用于定性檢測 ， 又可用于定量檢測 。用于定量檢測時線性范圍至少為 5個數(shù)量級。
6.   本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)。
7.    本產(chǎn)品只能用于科研。

規(guī)格及成分；

成分	編號	五孔盒包裝
探針法 qRT-PCR 緩沖液	190504a	500 μL（白蓋）
探針法 qRT-PCR 酶混合液	190504b	100 μL （紅蓋）
熒光 PCR 專用模板稀釋液	180701	1 mL（綠蓋）
乙型肝炎病毒前基因組  RNA 探針法 qRT-PCR 引物-探針混合液	15-55900yp	150 μL（棕色管）
乙型肝炎病毒前基因組  RNA 探針法 qRT-PCR 陽性對照(1×10E8 拷貝/μL)	55900pc	50  μL（黃蓋）
說明書	15-55900sc	1份

運(yùn)輸及保存；

低溫運(yùn)輸 ， -20℃保存 ，保存期限為  12 個月。

自備試劑;

樣品 RNA ，超純水。

使用方法;

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品 （以  10E2- 10E7 拷貝/μL 這 6 個  10 倍稀釋度為例） 。
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高 ， 因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行 ， 千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分 。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原 ，本 產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照 ，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1.  標(biāo)記 6 個離心管 ，分別為 7 ，6 ，5 ，4 ，3 ，2。
2.   用帶芯槍頭分別加入 45  μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液 ，最好用帶芯槍頭 ，下同。
3.   在 7 號管中加入 5  μL  1×10E8 拷貝/μL  的陽性對照(試劑盒提供) ，充分震蕩  1 分鐘 ，得  1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品 。放冰上待用。
4.   換槍頭 ， 在 6 號管中加入 5  μL  1×10E7 拷貝/μL  的陽性對照(上步稀釋所得) ，充分震蕩 1 分鐘 ，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5.   換槍頭 ， 在 5 號管中加入 5  μL  1×10E6 拷貝/μL  的陽性對照(上步稀釋所得) ，充分震蕩 1 分鐘 ，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6.   重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品 。放冰上待用。
二、樣品RNA的制備
7.   如果有 N 個樣品 ， 最好設(shè)置 N+2 個提取 ，多出的是 PC（樣品制備陽性對 照） 和 NC（樣品制備陰性對照）  。可以取陽性對照的  10000 倍稀釋液  10 μL  再加上一定量的水 ，使總體積與待提取樣品的規(guī)定體積一致 ， 以此作為PC 。另外用水作為 NC。
8.   用自選方法純化樣品的 RNA ，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容 。也可以選購本公司的柱式病毒 RNAout 或免提取核酸釋放劑。

三、 probeqRT-PCR反應(yīng)(20L體系，  在祥品制備室進(jìn)行)
9.   如果做定量分析并且只做  1 次重復(fù) ， 則標(biāo)記 N+9 個 RT-PCR 管 ，其中 N+2  個用于上步得到的 N+2 個樣品 ， 1 個用于 RT-PCR 陰性對照（用水做模板）， 6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線 。如果做定性分析并且只做  1 次重復(fù) ，則標(biāo)記 N+4 個 RT- PCR 管 ， 其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品 ， 1 個用于 RT-PCR  陰 性對照（用水做模板）  ， 1 個用于 RT-PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板） 。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù) 。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照 ， 并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好
后最后加）;

成分/每管	樣品管N+2個	RT-PCR陰性對照	標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管(2-7管)
探針法 qRT-PCR 緩沖液	10 μL	10 μL	10 μL
探針法 qRT-PCR 酶混合液	2 μL	2 μL	2 μL
乙型肝炎病毒前基因組  RNA 探針法 qRT-PCR 引物-探針混合液	3 μL	3 μL	3 μL
N+2 個待測 RNA 樣本	5  μL	不加	不加
自備超純水	不加	5  μL	不加
第 6 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（2-7 號）	不加	不加	5μL（ 2 號樣到 2 號管 ，3 號樣 到 3 號管 …）

11. 蓋上蓋子后上機(jī) ，按下面參數(shù)進(jìn)行 RT-PCR;

過程	溫度	時間
逆轉(zhuǎn)錄	50℃	20 min
預(yù)變性	94℃	5 min
RT-PCR 反應(yīng) （45 個循環(huán)）	94℃	20 sec
	62℃	20 sec （采集 FAM 通道的熒光信號）
	72℃	40 sec

四、數(shù)據(jù)處理
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測 ，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸 ， 以 Ct 值 為縱軸 ，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA濃度的 log 值 ， 再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測 ， 只判斷陽性或陰性 ，則陰性對照 Ct 必須大 于或等于 40 。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長 ， 有典型擴(kuò)增曲線 ，Ct 值應(yīng)該 小于或等于 38 。對待測樣品 ，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性 ，如果小 于或等于 38 則為陽性 。如果在 38-40 之間 ， 則重復(fù)一次 。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct值如果大于或等于 40 則為陰性 ， 如果小于 40 ，則為陽性。